CLC-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403513-ACT

Il gene umano **CLCN2** codifica il canale del cloro voltaggio-dipendente **CLC-2**, un trasportatore della membrana plasmatica e delle membrane interne che supporta la conduzione del cloruro, la stabilizzazione del potenziale di membrana e l’omeostasi epiteliale di ioni e fluidi. L’attività di CLC-2 contribuisce ai processi di trasporto transepiteliale e si integra con programmi di segnalazione che dipendono dal cloruro intracellulare come regolatore del controllo del volume cellulare e dell’eccitabilità elettrica. Nel sistema nervoso, CLC-2 influenza la gestione del cloruro, potendo modulare i gradienti intracellulari di cloruro e quindi la neurotrasmissione inibitoria. Una deregolazione dell’espressione di **CLCN2** o della funzione del canale è stata associata a fenotipi neurologici e a leucoencefalopatia ed è inoltre rilevante per studi sulla fisiologia della barriera epiteliale e sui disturbi del trasporto ionico.

CLC-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLCN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CLC-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLCN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLCN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CLC-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLCN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CLC-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CLC-2 nelle cellule tumorali con espressione di CLCN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.