CDKN2B/p15 INK4B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400570-ACT

CDKN2B codifica p15^INK4B, un inibitore delle chinasi ciclina-dipendenti che frena l’attività di CDK4/6 per mantenere il controllo, dipendente da RB, della transizione del ciclo cellulare da G1 a S. Limitando la segnalazione ciclina D–CDK, CDKN2B contribuisce ai checkpoint della proliferazione, ai programmi di senescenza cellulare e alle risposte a segnali anti-mitogenici, integrandosi con vie che convergono sullo stato di fosforilazione di RB. Una regolazione alterata del locus oncosoppressore INK4/ARF, incluso CDKN2B, è frequentemente implicata nel controllo deregolato del ciclo cellulare ed è oggetto di studio in contesti quali stress oncogenico, differenziamento e arresto della crescita associato all’infiammazione.

CDKN2B/p15 INK4B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDKN2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CDKN2B/p15 INK4B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDKN2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDKN2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CDKN2B/p15 INK4B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDKN2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CDKN2B/p15 INK4B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CDKN2B/p15 INK4B nelle cellule tumorali con espressione di CDKN2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.