Plasmide CRISPR d'Activation (h) CDKN2B/p15 INK4B: sc-400570-ACT

CDKN2B code p15^INK4B, un inhibiteur de kinases dépendantes des cyclines qui freine l’activité de CDK4/6 afin de maintenir le contrôle, dépendant de RB, de la transition du cycle cellulaire G1/S. En limitant la signalisation cycline D–CDK, CDKN2B contribue aux points de contrôle de la prolifération, aux programmes de sénescence cellulaire et aux réponses aux signaux anti-mitogènes, en s’intégrant à des voies qui convergent vers l’état de phosphorylation de RB. Une régulation altérée du locus suppresseur de tumeurs INK4/ARF, incluant CDKN2B, est fréquemment impliquée dans un contrôle déréglé du cycle cellulaire et est étudiée dans des contextes tels que le stress oncogénique, la différenciation et l’arrêt de croissance associé à l’inflammation.

CDKN2B/p15 INK4B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CDKN2B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CDKN2B/p15 INK4B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CDKN2B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CDKN2B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CDKN2B/p15 INK4B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CDKN2B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CDKN2B/p15 INK4B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CDKN2B/p15 INK4B dans les cellules tumorales présentant une expression de CDKN2B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.