Cdk2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400111-ACT

CDK2 codifica la chinasi ciclina-dipendente 2 (Cdk2), una chinasi serina/treonina che integra i segnali mitogenici con la progressione del ciclo cellulare. In complesso con le cicline E e A, Cdk2 promuove la transizione G1/S e la progressione della fase S fosforilando substrati coinvolti nella “licenza” della replicazione del DNA, nella dinamica delle forcelle replicative e nel controllo dei checkpoint. L’attività di CDK2 è coordinata con la segnalazione Rb–E2F, con le risposte allo stress replicativo mediate da ATR/CHK1 e con le reti di inibitori delle CDK come p21 e p27. Un’espressione o un’attivazione deregolata di CDK2 è spesso studiata in contesti di patologie proliferative e di instabilità genomica, in cui un controllo alterato del ciclo cellulare influisce sulla segnalazione oncogenica e sulla tolleranza al danno al DNA.

Cdk2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdk2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdk2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdk2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdk2 nelle cellule tumorali con espressione di CDK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.