Cdc42EP4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408523-ACT

CDC42EP4 codifica Cdc42EP4, un effettore delle GTPasi Cdc42/Rho che si lega alle septine e ai complessi associati all’actina per coordinare il rimodellamento del citoscheletro. Contribuisce alla formazione delle fibre di stress, alla dinamica delle adesioni focali e ai cambiamenti della forma cellulare che influenzano migrazione e adesione attraverso reti di segnalazione dipendenti dalle GTPasi Rho. Modulando l’organizzazione actomiosinica e i programmi di polarità cellulare, Cdc42EP4 è rilevante per studi sulle transizioni di tipo epitelio–mesenchimale, sul comportamento invasivo e sulle risposte al microambiente nelle cellule umane. Alterazioni dell’espressione di CDC42EP4 sono state riportate in contesti di motilità deregolata e di controllo del citoscheletro, a supporto del suo studio in biologia del cancro, nel rimodellamento associato alla fibrosi e in modelli di movimento cellulare durante lo sviluppo.

Cdc42EP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDC42EP4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdc42EP4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDC42EP4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDC42EP4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdc42EP4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDC42EP4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdc42EP4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdc42EP4 nelle cellule tumorali con espressione di CDC42EP4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.