CD154 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401682-ACT

CD40LG codifica CD154 (ligando di CD40), una proteina transmembrana di tipo II esposta transitoriamente sui linfociti T CD4+ attivati e su altri sottogruppi immunitari, che fornisce segnali co-stimolatori essenziali alle cellule B, alle cellule dendritiche e ai macrofagi che esprimono CD40. L’interazione CD154–CD40 promuove la formazione dei centri germinativi, la ricombinazione per lo switch di classe delle immunoglobuline e il “licensing” delle cellule dendritiche, integrando la presentazione dell’antigene con la polarizzazione della risposta immunitaria adattativa. La segnalazione a valle coinvolge l’attivazione, dipendente da TRAF, delle vie NF-κB, MAPK e PI3K, che regolano la produzione di citochine, la sopravvivenza e la differenziazione. Un’attività disregolata di CD40LG/CD154 è associata ad alterazioni dell’immunità umorale e a fenotipi immunitari infiammatori, a conferma della sua rilevanza negli studi sulla regolazione immunitaria e sui meccanismi associati all’autoimmunità.

CD154 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD40LG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD154 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD40LG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD40LG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD154. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD40LG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD154 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD154 nelle cellule tumorali con espressione di CD40LG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.