C12orf48 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408897-ACT

PARPBP (C12orf48) codifica la proteina legante PARP1, un fattore nucleare che si associa a PARP1 e supporta il mantenimento del genoma durante la replicazione del DNA. Contribuisce alla stabilità della forcella di replicazione e a risposte efficienti al danno al DNA, collegando i processi di riparazione associati alla cromatina con la progressione della fase S. La funzione di PARPBP è stata collegata a vie che regolano lo stress replicativo, la segnalazione dei checkpoint e il controllo del ciclo cellulare. Un’espressione deregolata o una dipendenza da PARPBP sono state osservate in contesti di instabilità genomica, rendendolo rilevante per lo studio della fitness delle cellule tumorali e delle vulnerabilità nella riparazione del DNA in modelli cellulari umani.

C12orf48 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PARPBP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C12orf48 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PARPBP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PARPBP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C12orf48. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PARPBP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C12orf48 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C12orf48 nelle cellule tumorali con espressione di PARPBP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.