BMAL1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400808-ACT

ARNTL (BMAL1) è un fattore di trascrizione di base elica–ansa–elica (bHLH) con dominio PAS fondamentale, che forma eterodimeri con CLOCK/NPAS2 per guidare i programmi di espressione genica circadiana tramite elementi E-box. Questo complesso regola le oscillazioni giornaliere del metabolismo, della funzione mitocondriale, dell’equilibrio redox, delle risposte al danno del DNA e della segnalazione immunitaria, coordinando circuiti di feedback trascrizionale con i repressori PER e CRY. Nella biologia umana, un’alterata attività di BMAL1 è stata collegata alla perturbazione dei ritmi circadiani, con effetti a valle sull’omeostasi metabolica, sulle vie infiammatorie, su fenotipi neurocomportamentali e sulla resilienza cellulare allo stress. BMAL1 interagisce inoltre con le reti dell’ipossia e dei recettori nucleari, rendendolo un nodo utile per studiare in vitro la regolazione temporale della trascrizione e la fisiologia a livello di sistema.

BMAL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARNTL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BMAL1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARNTL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARNTL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BMAL1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARNTL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BMAL1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BMAL1 nelle cellule tumorali con espressione di ARNTL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.