BLM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400896-ACT

BLM codifica un’elicasi del DNA della famiglia RecQ che salvaguarda la stabilità del genoma risolvendo strutture anomale del DNA durante la replicazione e la ricombinazione. BLM agisce nella riparazione per ricombinazione omologa, nel riavvio delle forcelle di replicazione e nella dissoluzione delle doppie giunzioni di Holliday insieme al complesso TOP3A–RMI1/2, limitando così gli scambi tra cromatidi fratelli e i riarrangiamenti cromosomici. È integrato nelle reti di risposta al danno al DNA che coinvolgono la segnalazione ATR/ATM e influenza il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare in condizioni di stress replicativo. La perdita dell’attività di BLM è associata a un aumento del carico mutazionale e a fenotipi di instabilità cromosomica caratteristici della sindrome di Bloom, ed è rilevante per gli studi sui difetti di mantenimento del genoma associati al cancro.

BLM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BLM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BLM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BLM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BLM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BLM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BLM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BLM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BLM nelle cellule tumorali con espressione di BLM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.