BCKDE1A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417950-ACT

BCKDHA codifica la subunità E1α del complesso della deidrogenasi degli α-chetoacidi a catena ramificata (BCKDH), un sistema multienzimatico mitocondriale che catalizza la decarbossilazione ossidativa degli α-chetoacidi a catena ramificata derivati da leucina, isoleucina e valina. Questa reazione è centrale nel catabolismo degli amminoacidi a catena ramificata e collega lo stato nutrizionale alla produzione di acetil-CoA/succinil-CoA, al bilanciamento redox mitocondriale e al metabolismo energetico cellulare. L’attività di BCKDH è regolata in modo rigoroso da fosforilazione e defosforilazione, integrando i segnali di BCKDK e PPM1K per modulare il flusso metabolico. La disregolazione di BCKDHA e la compromissione della funzione di BCKDH sono associate a errori congeniti del metabolismo e sono ampiamente studiate nel contesto della disfunzione mitocondriale e dell’alterata omeostasi degli amminoacidi.

BCKDE1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BCKDHA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BCKDE1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BCKDHA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BCKDHA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BCKDE1A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BCKDHA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BCKDE1A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BCKDE1A nelle cellule tumorali con espressione di BCKDHA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.