BCAP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404405-ACT

PIK3AP1 codifica BCAP (B cell adaptor for PI3K), una proteina “scaffold” di segnalazione che collega gli input provenienti dal recettore dell’antigene e dai recettori dell’immunità innata all’attivazione della PI3K di classe I nelle cellule ematopoietiche. Attraverso interazioni con recettori contenenti fosfotirosina e con componenti regolatorie della PI3K, BCAP promuove la segnalazione a valle AKT/mTOR, influenza gli output delle vie NF-κB e MAPK e contribuisce a modulare la produzione di citochine, nonché programmi di sopravvivenza e differenziamento. In immunologia umana, alterazioni della segnalazione PIK3AP1/BCAP sono state associate a risposte disregolate delle cellule B e delle cellule mieloidi, contribuendo a fenotipi infiammatori e a disfunzioni del sistema immunitario. La sua posizione nella via di segnalazione lo rende un nodo utile per studiare l’integrazione dei segnali prossimali al recettore e il controllo a feedback negli stati di attivazione delle cellule immunitarie.

BCAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIK3AP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BCAP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIK3AP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIK3AP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BCAP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIK3AP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BCAP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BCAP nelle cellule tumorali con espressione di PIK3AP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.