ATP-citrate synthase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403146-ACT

ACLY kodiert die ATP-Citrat-Synthase, ein zytosolisches Enzym, das Citrat und CoA in Acetyl-CoA und Oxalacetat umwandelt und damit den mitochondrialen Kohlenstofffluss mit der Lipid- und Cholesterinbiosynthese verknüpft. Durch die Bereitstellung von Acetyl-CoA für die Fettsäuresynthese und die Proteinacetylierung beeinflusst ACLY die metabolische Umprogrammierung, das Redoxgleichgewicht und die epigenetische Regulation der Genexpression. Dieser Knotenpunkt integriert Signale aus der Glykolyse, dem Citratzyklus und nährstoffsensitiven Signalwegen, um Proliferations- und Differenzierungsprogramme zu steuern. Eine fehlregulierte ACLY-Aktivität wurde mit veränderter Lipogenese sowie veränderten Acetylierungsmustern in Zusammenhängen der Stoffwechselkrankheits- und Onkologieforschung in Verbindung gebracht.

ATP-citrate synthase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACLY-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATP-citrate synthase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACLY-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACLY-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATP-citrate synthase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACLY-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATP-citrate synthase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATP-citrate synthase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACLY-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.