ASIC3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405106-ACT

ASIC3 umano (subunità 3 del canale ionico sensibile agli acidi) è un canale cationico della famiglia DEG/ENaC, attivato dai protoni e sensibile all’amiloride, che si apre in risposta all’acidificazione extracellulare, consentendo l’ingresso di Na⁺ e la depolarizzazione della membrana. È altamente rilevante per l’eccitabilità dei neuroni sensoriali e trasduce le variazioni di pH tissutale associate a infiammazione, ischemia e stress meccanico, integrandosi con processi più ampi di omeostasi ionica e di segnalazione eccitatoria. L’attività di ASIC3 influenza indirettamente la segnalazione a valle dipendente dal calcio attraverso vie guidate dalla depolarizzazione e contribuisce ai circuiti nocicettivi e meccanosensoriali. In ambito di ricerca, un’espressione o una funzione disregolata di ASIC3 è stata collegata a ipersensibilità al dolore, risposte infiammatorie e aspetti della fisiologia neuromuscolare o muscoloscheletrica in microambienti acidi.

ASIC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ASIC3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ASIC3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ASIC3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ASIC3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ASIC3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ASIC3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ASIC3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ASIC3 nelle cellule tumorali con espressione di ASIC3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.