ARRDC4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406413-ACT

ARRDC4 (arrestin domain containing 4) è un adattatore umano della famiglia delle α-arrestine, implicato nella regolazione del traffico delle proteine di membrana e nell’attenuazione del segnale, accoppiando recettori e trasportatori a vie endocitiche e dipendenti dall’ubiquitina. È stato associato alle risposte cellulari allo stress energetico e da carenza di nutrienti, inclusa la modulazione del metabolismo di glucosio e lipidi tramite interazioni con reti di segnalazione metabolica. L’espressione di ARRDC4 risponde a segnali/metacue metabolici e può influenzare il turnover dei recettori e i programmi trascrizionali a valle che modellano l’adattamento cellulare allo stress. Un’attività o un’espressione deregolata di ARRDC4 è stata indagata in contesti associati a disfunzioni metaboliche e ad alterazioni dell’omeostasi della segnalazione, rilevanti per la biologia delle malattie complesse.

ARRDC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARRDC4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARRDC4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARRDC4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARRDC4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARRDC4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARRDC4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARRDC4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARRDC4 nelle cellule tumorali con espressione di ARRDC4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.