Ape2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407307-ACT

APEX2 umano codifica l’endonucleasi apurinica/apirimidinica 2 (Ape2), una nucleasi multifunzionale che contribuisce al mantenimento dell’integrità del genoma durante la riparazione per escissione di basi e l’elaborazione di lesioni del DNA abasiche. Ape2 partecipa alle risposte al danno al DNA associate alla replicazione e sostiene la segnalazione dei checkpoint coordinandosi con fattori di riparazione e di replicazione, contribuendo a preservare la stabilità della forcella replicativa in condizioni di stress genotossico. Un’attività alterata di APEX2 è stata associata a un aumento del carico mutazionale e a una maggiore sensibilità al danno ossidativo, collegando questa via a meccanismi rilevanti per la biologia del cancro e per altri disturbi determinati da una riparazione del DNA compromessa. Di conseguenza, APEX2 è spesso studiato nel contesto della manutenzione del genoma, dello stress replicativo e delle risposte cellulari ad agenti che danneggiano il DNA.

Ape2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di APEX2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ape2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus APEX2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione APEX2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ape2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus APEX2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ape2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ape2 nelle cellule tumorali con espressione di APEX2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.