Plásmido CRISPR de Activación (m) ANKTM1: sc-435491-ACT

El gen murino Trpa1 codifica ANKTM1 (TRPA1), un canal catiónico no selectivo de la familia de los receptores potenciales transitorios, enriquecido en neuronas sensoriales y otros tipos celulares que detectan irritantes químicos, estrés oxidativo y señales relacionadas con la temperatura. La apertura del canal favorece la entrada de Ca2+, que se acopla a la inflamación neurogénica y a la señalización asociada al dolor mediante vías dependientes de calcio, cascadas de MAPK y programas transcripcionales posteriores. La actividad de ANKTM1 se integra con la detección de electrófilos reactivos y procesos regulados por el estado redox, influyendo en las respuestas celulares a la lesión tisular y a mediadores inflamatorios. Las alteraciones en la señalización de TRPA1 se han vinculado a modelos de dolor neuropático, prurito, irritación de las vías aéreas e hipersensibilidad inflamatoria, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos de circuitos somatosensoriales e inflamatorios.

ANKTM1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Trpa1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ANKTM1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Trpa1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Trpa1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ANKTM1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Trpa1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ANKTM1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ANKTM1 en células tumorales con expresión de Trpa1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.