ANKTM1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-435491-ACT

Il gene murino Trpa1 codifica ANKTM1 (TRPA1), un canale cationico non selettivo della famiglia dei recettori a potenziale transitorio, arricchito nei neuroni sensoriali e in altri tipi cellulari che rilevano irritanti chimici, stress ossidativo e segnali legati alla temperatura. L’apertura del canale favorisce l’ingresso di Ca2+ che si collega all’infiammazione neurogena e alla segnalazione associata al dolore attraverso vie dipendenti dal calcio, cascate MAPK e programmi trascrizionali a valle. L’attività di ANKTM1 si integra con il rilevamento di elettrofili reattivi e con processi regolati dallo stato redox, influenzando le risposte cellulari alla lesione tissutale e ai mediatori infiammatori. Alterazioni della segnalazione di TRPA1 sono state associate a modelli di dolore neuropatico, prurito, irritazione delle vie aeree e ipersensibilità infiammatoria, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici dei circuiti somatosensoriali e infiammatori.

ANKTM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Trpa1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANKTM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Trpa1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Trpa1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANKTM1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Trpa1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANKTM1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANKTM1 nelle cellule tumorali con espressione di Trpa1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.