ANKTM1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402245-ACT

TRPA1 umano (noto anche come ANKTM1) codifica un canale cationico non selettivo, permeabile al calcio, appartenente alla sottofamiglia ankyrin dei recettori potenziali transitori (TRP), che funge da sensore polimodale per elettrofili reattivi, segnali di stress ossidativo e stimoli legati alla temperatura. L’ingresso di Ca²⁺ mediato da TRPA1 collega irritanti ambientali ed endogeni all’eccitabilità neuronale, all’infiammazione neurogena e alla segnalazione a valle attraverso MAPK, NF-κB e programmi trascrizionali dipendenti dal Ca²⁺. Il canale è studiato in modo particolare nei neuroni sensoriali e nei tessuti periferici, dove modula la nocicezione, la tosse e i riflessi delle vie aeree, nonché le risposte infiammatorie. Un’attività di TRPA1 deregolata è stata implicata in meccanismi rilevanti per stati di dolore cronico, emicrania, asma e ipersensibilità delle vie aeree, e per la biologia delle malattie infiammatorie, a supporto del suo impiego nella genomica funzionale focalizzata su specifiche vie di segnalazione.

ANKTM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRPA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ANKTM1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRPA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRPA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ANKTM1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRPA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ANKTM1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ANKTM1 nelle cellule tumorali con espressione di TRPA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.