Alix Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400350-ACT

PDCD6IP codifica Alix, un adattatore associato all’ESCRT che coordina lo smistamento endosomiale, la biogenesi dei corpi multivescicolari, l’abscissione citocinetica e la riparazione della membrana plasmatica attraverso interazioni con componenti di ESCRT-III e con syntenin. Alix partecipa inoltre alla formazione degli esosomi e alla downregulation dei recettori, influenzando vie di segnalazione che dipendono dal traffico di membrana e dalla selezione di carichi dipendente dall’ubiquitina. Grazie ai suoi ruoli nel rimodellamento delle membrane e nel coordinamento del citoscheletro, Alix incide su processi correlati all’autofagia e sul budding virale dei virus con envelope che sfruttano la macchina ESCRT. La deregolazione del traffico legato a PDCD6IP/Alix e della dinamica delle vescicole extracellulari è stata associata a fenotipi rilevanti per l’invasione delle cellule tumorali, la neurodegenerazione e un’alterata segnalazione immunitaria, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici delle vie di segnalazione.

Alix Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PDCD6IP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Alix Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PDCD6IP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PDCD6IP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Alix. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PDCD6IP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Alix nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Alix nelle cellule tumorali con espressione di PDCD6IP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.