Aldolase B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402714-ACT

ALDOB codifica l’aldolasi B umana, un enzima glicolitico e fruttolitico che catalizza la scissione del fruttosio-1,6-bisfosfato e del fruttosio-1-fosfato, sostenendo l’utilizzo dei carboidrati e il metabolismo energetico. L’attività dell’aldolasi B è centrale nella gestione epatica del fruttosio e si integra con la glicolisi, la gluconeogenesi e, più in generale, con il controllo dei flussi di carbonio. Alterazioni dell’espressione o della funzione di ALDOB sono collegate a errori congeniti del metabolismo del fruttosio e sono state associate a una disregolazione metabolica che influisce sulla fisiologia epatica. In quanto nodo metabolico, ALDOB viene frequentemente valutato in studi sul sensing dei nutrienti, sulla differenziazione degli epatociti e sul rimodellamento delle vie metaboliche in modelli cellulari rilevanti per la malattia.

Aldolase B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ALDOB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Aldolase B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ALDOB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ALDOB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Aldolase B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ALDOB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Aldolase B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Aldolase B nelle cellule tumorali con espressione di ALDOB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.