AKR1D1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404897-ACT

AKR1D1 codifica la 5β-reduttasi degli steroidi, una aldo-cheto reduttasi che catalizza una fase essenziale della biosintesi degli acidi biliari convertendo gli steroidi Δ4-3-cheto in intermedi 5β-ridotti. Questa attività sostiene il catabolismo epatico del colesterolo, l’omeostasi degli acidi biliari e la segnalazione metabolica a valle tramite recettori nucleari sensibili agli acidi biliari, come FXR, collegando AKR1D1 a vie più ampie di regolazione dei lipidi e del glucosio. Alterazioni dell’espressione o della funzione di AKR1D1 possono perturbare la composizione degli acidi biliari e il metabolismo degli steroidi, con implicazioni per fenotipi colestatici e disfunzione metabolica epatica. In quanto enzima arricchito nel fegato, AKR1D1 è spesso studiato in modelli di epatociti per definire come il flusso degli acidi biliari e la clearance degli steroidi influenzino le risposte infiammatorie e allo stress metabolico.

AKR1D1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKR1D1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AKR1D1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKR1D1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKR1D1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AKR1D1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKR1D1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AKR1D1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AKR1D1 nelle cellule tumorali con espressione di AKR1D1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.