AICAR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404771-ACT

L’ATIC umano codifica l’enzima bifunzionale 5-aminoimidazolo-4-carbossammide ribonucleotide formiltransferasi/cicloidrolasi dell’IMP (AICAR), che catalizza le ultime due fasi della biosintesi de novo delle purine, portando alla produzione di inosina monofosfato. Attraverso il suo ruolo nel trasferimento di gruppi formile dipendente dal metabolismo a un carbonio e nel mantenimento dei pool di nucleotidi, ATIC supporta la sintesi di DNA/RNA, la progressione del ciclo cellulare e l’omeostasi metabolica. Alterazioni dell’attività di ATIC possono influire sulla capacità proliferativa e sulle risposte allo stress replicativo, collegando la disregolazione della via delle purine al metabolismo delle cellule tumorali e a più ampie vulnerabilità metaboliche. Difetti ereditari di questa via sono stati associati a fenotipi di tipo neurosviluppativo e metabolico, a sottolineare l’importanza di un controllo rigoroso della sintesi delle purine.

AICAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ATIC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

AICAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ATIC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ATIC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di AICAR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ATIC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da AICAR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via AICAR nelle cellule tumorali con espressione di ATIC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.