ADHγ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402261-ACT

ADH1C codifica la subunità gamma dell’alcol deidrogenasi umana (ADHγ), un’ossidoreduttasi citosolica zinco-dipendente che catalizza la conversione NAD⁺-dipendente dell’etanolo e di altri alcoli a catena corta nei rispettivi aldeidi. Questo enzima contribuisce al metabolismo dell’alcol a livello epatico e gastrointestinale e interagisce con la gestione dei retinoidi e delle aldeidi derivate dai lipidi attraverso l’interconversione alcol/aldeide e il bilanciamento redox. Variazioni nell’espressione o nell’attività di ADH1C possono modulare la produzione di acetaldeide e lo stress ossidativo, influenzando la suscettibilità a danni tissutali correlati all’alcol e fenotipi metabolici più ampi. Di conseguenza, ADHγ è spesso studiata in percorsi che collegano il metabolismo degli xenobiotici, l’omeostasi redox cellulare e la segnalazione infiammatoria.

ADHγ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADH1C senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADHγ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADH1C nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADH1C, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADHγ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADH1C nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADHγ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADHγ nelle cellule tumorali con espressione di ADH1C silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.