Acid Ceramidase Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-419216-ACT

Il gene Asah1 del topo codifica la ceramidasi acida, un’idrolasi lisosomiale che deacila la ceramide generando sfingosina e acidi grassi liberi, modulando l’equilibrio tra accumulo e turnover degli sfingolipidi. Regolando i pool di ceramide e sfingosina, la ceramidasi acida influenza il traffico di membrana dipendente dai lisosomi, l’autofagia e reti di segnalazione sensibili allo stress collegate alla sopravvivenza cellulare e alle risposte infiammatorie. L’alterazione dell’attività di ASAH1 è associata ad accumulo di sfingolipidi e disfunzione lisosomiale, collegando questa via a fenotipi neurodegenerativi e metabolici sistemici. Asah1 è quindi un nodo chiave per studiare la segnalazione lipidica centrata sulla ceramide e l’omeostasi lisosomiale in modelli murini cellulari e in vivo.

Acid Ceramidase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Asah1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Acid Ceramidase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Asah1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Asah1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Acid Ceramidase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Asah1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Acid Ceramidase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Acid Ceramidase nelle cellule tumorali con espressione di Asah1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.