20S Proteasome β3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409667-ACT

PSMB3 codifica per la subunità β3 del core catalitico del proteasoma 20S umano, un componente strutturale del proteasoma 26S che consente il turnover ATP-dipendente delle proteine ubiquitinate. La proteolisi mediata dal proteasoma regola il controllo qualità delle proteine, la processazione dell’antigene e la progressione del ciclo cellulare, e interagisce con vie che controllano le risposte allo stress, la segnalazione del danno al DNA e l’attività di NF-κB. Alterazioni nell’espressione delle subunità del proteasoma possono rimodellare la proteostasi e modificare la degradazione di proteine regolatorie a breve emivita, influenzando apoptosi, proliferazione e segnalazione immunitaria. Una funzione del proteasoma deregolata e una composizione delle subunità alterata sono state associate alla biologia del cancro, alla neurodegenerazione e alla fisiopatologia infiammatoria attraverso effetti estesi sull’omeostasi proteica.

20S Proteasome β3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSMB3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

20S Proteasome β3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSMB3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSMB3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 20S Proteasome β3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSMB3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 20S Proteasome β3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 20S Proteasome β3 nelle cellule tumorali con espressione di PSMB3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.