γ-sarcoglycan Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402275-ACT

SGCG codifica la γ-sarcoglicana, un componente centrale del complesso dei sarcoglicani all’interno del complesso delle glicoproteine associate alla distrofina, che stabilizza la membrana della cellula muscolare durante la contrazione. La γ-sarcoglicana contribuisce all’accoppiamento tra citoscheletro e matrice extracellulare, sostenendo l’integrità del sarcolemma e la meccanotrasduzione nel muscolo striato. L’alterazione di SGCG compromette l’assemblaggio del complesso dei sarcoglicani e la stabilità della membrana, favorendo segnali associati al danno, una gestione del calcio alterata e un rimodellamento responsivo allo stress. La disfunzione di SGCG è geneticamente associata a fenotipi di distrofia muscolare, rendendolo un bersaglio rilevante per lo studio della biologia del complesso distrofina-glicoproteina e dei meccanismi di degenerazione muscolare.

γ-sarcoglycan Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SGCG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

γ-sarcoglycan Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SGCG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SGCG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di γ-sarcoglycan. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SGCG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da γ-sarcoglycan nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via γ-sarcoglycan nelle cellule tumorali con espressione di SGCG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.