αENaC Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422825-ACT

Scnn1a codifica la subunità alfa (αENaC) del canale epiteliale del sodio del topo, un componente che forma il poro ed è necessario per il trasporto di Na⁺ sensibile all’amiloride attraverso le membrane epiteliali. αENaC contribuisce all’assorbimento apicale di sodio che influenza l’omeostasi del liquido di superficie delle vie aeree, la clearance del fluido alveolare e l’equilibrio elettrolitico transepiteliale in rene, polmone e colon distale. L’attività del canale è integrata con la segnalazione dell’aldosterone e con un gating dipendente dalle proteasi, ed è modulata da vie di traffico dipendenti dall’ubiquitina, come la regolazione mediata da NEDD4-2. La disfunzione di ENaC è ampiamente utilizzata come modello di alterata gestione di sali e fluidi, collegando l’espressione di Scnn1a a studi sulla disidratazione delle vie aeree, sui fenotipi di ostruzione da muco e sulla fisiologia correlata alla pressione arteriosa in vivo e in epiteli coltivati.

αENaC Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Scnn1a senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

αENaC Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Scnn1a nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Scnn1a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di αENaC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Scnn1a nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da αENaC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via αENaC nelle cellule tumorali con espressione di Scnn1a silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.