Wnt-10a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403285-ACT

WNT10A codifica Wnt-10a, un ligando secreto della famiglia Wnt che regola la specificazione del destino cellulare, la proliferazione e la definizione dei pattern tissutali attraverso la segnalazione canonica β-catenina/TCF e vie Wnt non canoniche dipendenti dal contesto. L’attività di Wnt-10a influenza le interazioni epitelio-mesenchimali e i programmi di differenziamento, con ruoli importanti nello sviluppo e nel mantenimento degli annessi ectodermici quali follicoli piliferi e denti. Una segnalazione WNT10A deregolata è stata associata a displasie ectodermiche congenite e a difetti odontogenici; inoltre, la sua espressione alterata è oggetto di studio anche nei tumori, dove il rimodellamento delle vie Wnt influenza il comportamento delle cellule tumorali e le risposte dello stroma. In quanto nodo di via, WNT10A è spesso utilizzato per interrogare effetti specifici dei ligandi Wnt su reti trascrizionali, morfogenesi e dinamiche di cellule staminali/progenitrici.

Wnt-10a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di WNT10A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wnt-10a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus WNT10A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione WNT10A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wnt-10a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus WNT10A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wnt-10a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wnt-10a nelle cellule tumorali con espressione di WNT10A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.