VPS4A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402005-ACT

Il gene umano VPS4A codifica un’ATPasi AAA+ che fornisce l’energia per lo smontaggio e il riciclo di ESCRT-III, consentendo eventi di rimodellamento di membrana necessari per la biogenesi dei corpi multivescicolari, lo smistamento del carico endosomiale, l’abscissione durante la citodieresi e la riparazione della membrana plasmatica. L’attività di VPS4A si coordina con i componenti ESCRT per regolare la downregulation dei recettori, la biogenesi di esosomi e microvescicole e la chiusura dell’involucro nucleare dopo la mitosi. Grazie al suo ruolo centrale nel traffico endolisosomiale e nella fissione di membrana, VPS4A è frequentemente studiata in vie che influenzano la proteostasi, la segnalazione dell’immunità innata e il budding virale che sfrutta la macchina ESCRT. La disregolazione delle funzioni ESCRT/VPS4 è stata associata a fenotipi neurodegenerativi, ad alterazioni della segnalazione dei fattori di crescita e a cambiamenti legati al cancro nel traffico vescicolare e nella divisione cellulare.

VPS4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VPS4A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VPS4A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VPS4A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VPS4A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VPS4A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VPS4A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VPS4A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VPS4A nelle cellule tumorali con espressione di VPS4A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.