VILIP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401100-ACT

VSNL1 codifica la proteina visinin-like 1 (VILIP-1), un sensore neuronale del calcio della famiglia EF-hand che va incontro a cambiamenti conformazionali Ca2+-dipendenti per regolare la segnalazione a livello delle membrane. VILIP-1 partecipa alla modulazione dell’attività sinaptica e dell’eccitabilità neuronale accoppiata al Ca2+, influenzando le vie dei secondi messaggeri e i programmi trascrizionali a valle importanti per la neuroplasticità. Alterazioni dell’espressione di VSNL1/VILIP-1 e della dinamica della segnalazione del calcio sono state associate a processi rilevanti per malattie neurodegenerative e neuropsichiatriche, inclusi le risposte neuronali allo stress e la disfunzione sinaptica. Di conseguenza, VSNL1 è spesso studiato in modelli di differenziamento neuronale, segnalazione dipendente dall’attività e fenotipi molecolari associati a biomarcatori.

VILIP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di VSNL1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VILIP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus VSNL1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione VSNL1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VILIP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus VSNL1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VILIP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VILIP-1 nelle cellule tumorali con espressione di VSNL1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.