USP6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406687-ACT

USP6 (ubiquitin specific peptidase 6) codifica un enzima deubiquitinante che modula la stabilità delle proteine e l’output di segnalazione invertendo la coniugazione dell’ubiquitina. Attraverso la regolazione del turnover e del traffico dipendenti dall’ubiquitina, USP6 può influenzare vie associate alla segnalazione recettoriale, al rimodellamento del citoscheletro e a programmi trascrizionali infiammatori, incluse le risposte associate a NF-κB. Un’espressione deregolata di USP6 è fortemente associata a neoplasie mesenchimali benigne quali la cisti ossea aneurismatica e la fascite nodulare, in cui eventi di scambio del promotore determinano una trascrizione aberrante. Di conseguenza, USP6 è ampiamente studiato per comprendere come una deubiquitinazione alterata rimodelli le reti di segnalazione cellulare e i fenotipi rilevanti per il microambiente tumorale.

USP6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USP6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

USP6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USP6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USP6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di USP6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USP6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da USP6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via USP6 nelle cellule tumorali con espressione di USP6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.