UBE2S Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404140-ACT

UBE2S (enzima coniugante l’ubiquitina E2 S) è un enzima E2 coniugante l’ubiquitina che estende catene di poliubiquitina legate a K11, operando insieme al complesso promotore dell’anafase/ciclosoma (APC/C) per favorire l’ubiquitinazione tempestiva e la degradazione dei regolatori del ciclo cellulare. Attraverso questa attività, UBE2S contribuisce a coordinare la progressione mitotica, il soddisfacimento del checkpoint del fuso e un’uscita ordinata dalla mitosi, sostenendo così la stabilità del genoma e una proliferazione controllata. Un’espressione o un’attività deregolata di UBE2S è stata associata ad alterazioni della proteostasi e del controllo del ciclo cellulare in molteplici contesti patologici, inclusi i tumori, nei quali è comune il rimodellamento delle vie dell’ubiquitina. In quanto nodo della segnalazione dipendente dall’ubiquitina, UBE2S viene anche utilizzato per studiare il crosstalk tra la funzione dell’APC/C, il turnover mediato dal proteasoma e le vie di risposta allo stress che influenzano le decisioni sul destino cellulare.

UBE2S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UBE2S senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UBE2S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UBE2S nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UBE2S, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UBE2S. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UBE2S nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UBE2S nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UBE2S nelle cellule tumorali con espressione di UBE2S silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.