Tie-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401506-ACT

TIE1 codifica Tie-1, una tirosin-chinasi recettoriale endoteliale che modula la segnalazione angiogenica e l’omeostasi vascolare attraverso interazioni con l’asse Tie2/angiopoietine e con le vie a valle PI3K–AKT e MAPK. Tie-1 influenza la sopravvivenza delle cellule endoteliali, l’integrità delle giunzioni e le risposte allo stress da taglio (shear stress), contribuendo così alla maturazione e al rimodellamento dei vasi. Un’espressione o una segnalazione di TIE1 deregolate sono state associate a neovascolarizzazione patologica, disfunzione vascolare legata all’infiammazione e angiogenesi associata ai tumori. In quanto regolatore arricchito a livello vascolare, Tie-1 è spesso studiato nella biologia endoteliale, nella permeabilità vascolare e nel crosstalk del microambiente nei modelli di malattia.

Tie-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TIE1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tie-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TIE1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TIE1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tie-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TIE1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tie-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tie-1 nelle cellule tumorali con espressione di TIE1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.