THP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401238-ACT

UMOD codifica l’uromodulina (THP), la glicoproteina più abbondante secreta nelle urine umane normali e un prodotto caratteristico delle cellule epiteliali del tratto ascendente spesso dell’ansa di Henle. La THP viene sintetizzata nel reticolo endoplasmatico, subisce un’estesa glicosilazione e l’ancoraggio tramite GPI, ed è rilasciata dal versante apicale per influenzare l’omeostasi tubulare, l’aggregazione proteica e le interazioni con ioni urinari e microrganismi. L’espressione di UMOD e la maturazione della proteina sono collegate alle vie di proteostasi epiteliale, inclusi il controllo qualità nel RE e il traffico attraverso il Golgi, e possono modulare la segnalazione infiammatoria nel microambiente tubulare renale. La variabilità genetica o una deregolazione dell’espressione di UMOD è associata alla suscettibilità alle malattie renali e alla patologia tubulo-interstiziale, rendendolo un locus utile per studiare la funzione dell’epitelio renale e le risposte allo stress.

THP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UMOD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

THP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UMOD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UMOD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di THP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UMOD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da THP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via THP nelle cellule tumorali con espressione di UMOD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.