TFE3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437344-ACT

Il gene Tfe3 del topo codifica il fattore di trascrizione TFE3, un membro della famiglia MiT/TFE che si lega ai motivi E-box per coordinare programmi che controllano la biogenesi lisosomiale, l’autofagia, il metabolismo cellulare e l’adattamento allo stress. TFE3 integra segnali di rilevamento dei nutrienti, inclusa la regolazione dipendente da mTORC1, per modulare output trascrizionali legati al traffico endolisosomiale e all’omeostasi mitocondriale. Un’attività deregolata di TFE3 è stata associata ad alterazioni del flusso catabolico, a segnali immunitari e infiammatori aberranti e a una riprogrammazione trascrizionale oncogenica in modelli di tumorigenesi. Nella ricerca biomedica, Tfe3 viene comunemente studiato per il suo ruolo nelle reti geniche lisosomiali guidate da TFEB/TFE3, nel rimodellamento metabolico e negli effetti dipendenti dal contesto su proliferazione e differenziamento.

TFE3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tfe3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFE3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tfe3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tfe3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFE3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tfe3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFE3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFE3 nelle cellule tumorali con espressione di Tfe3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.