survivin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400205-ACT

BIRC5 codifica la survivina, una proteina multifunzionale inibitrice dell’apoptosi che funge anche da componente centrale del complesso dei passeggeri cromosomici, coordinando la progressione mitotica, la segregazione dei cromosomi e la citocinesi. La survivina integra segnali che regolano il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare e la sopravvivenza cellulare modulando l’attività delle caspasi e la dinamica del fuso mitotico. Un’espressione deregolata di BIRC5 è spesso associata ad aumentata proliferazione e resistenza all’apoptosi, motivo per cui viene ampiamente utilizzato come marcatore molecolare negli studi sulla segnalazione oncogenica, sulla stabilità del genoma e sulle vie di risposta allo stress. In quanto gene umano fortemente dipendente dal ciclo cellulare, BIRC5 rappresenta un nodo sperimentale gestibile per interrogare programmi trascrizionali legati alla mitosi e reti di proteostasi in diversi modelli cellulari.

survivin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BIRC5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

survivin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BIRC5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BIRC5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di survivin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BIRC5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da survivin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via survivin nelle cellule tumorali con espressione di BIRC5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.