SURF-4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423221-ACT

Surf4 codifica SURF-4, una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) evolutivamente conservata, implicata nel funzionamento della via secretoria precoce e nel traffico dal RE all’apparato di Golgi. SURF-4 partecipa a meccanismi di selezione e ritenzione del carico che aiutano a coordinare lo smistamento delle proteine, la secrezione e la proteostasi, processi strettamente legati alle risposte allo stress del RE. Alterazioni del traffico secretorio e dell’omeostasi del RE sono ampiamente rilevanti per la disregolazione metabolica, l’infiammazione e fenotipi neurodegenerativi nei sistemi modello, rendendo Surf4 un nodo utile per studiare come il carico biosintetico influenzi la fisiologia cellulare. Nella ricerca sul topo, la modulazione di Surf4 supporta studi sul controllo della via secretoria in epatociti, cellule immunitarie e altri tessuti con elevata richiesta secretoria.

SURF-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Surf4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SURF-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Surf4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Surf4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SURF-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Surf4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SURF-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SURF-4 nelle cellule tumorali con espressione di Surf4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.