Smad6 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421529-ACT

Smad6 codifica una proteina SMAD inibitoria che agisce come regolatore di feedback negativo della segnalazione BMP e, in alcuni contesti, della segnalazione TGF-β, interferendo con l’attivazione delle SMAD regolate dal recettore e con i programmi trascrizionali a valle. Nelle cellule murine, SMAD6 contribuisce a modulare i processi guidati da BMP, quali la differenziazione osteogenica, l’omeostasi vascolare e il patterning dello sviluppo, limitando l’intensità e la durata del segnale. Attraverso la modulazione dell’espressione genica canonica SMAD-dipendente, SMAD6 influenza le decisioni sul destino cellulare, la proliferazione e il rimodellamento della matrice extracellulare. Un’attività disregolata di SMAD6 è stata associata in letteratura a un’alterata attività della via BMP correlata a fenotipi congeniti e cardiovascolari e ad anomalie dello sviluppo scheletrico, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici delle vie di segnalazione.

Smad6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Smad6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smad6 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Smad6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Smad6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smad6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Smad6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smad6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smad6 nelle cellule tumorali con espressione di Smad6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.