Smad4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400110-ACT

SMAD4 codifica Smad4, un co-mediatore trascrizionale centrale della rete di segnalazione TGF-β/BMP, che forma complessi con gli SMAD regolati dal recettore per controllare programmi di espressione genica dipendenti dal contesto. Attraverso questi complessi, Smad4 regola processi che includono il controllo del ciclo cellulare, la differenziazione, le dinamiche epitelio-mesenchimali e il rimodellamento della matrice extracellulare. L’alterazione della trascrizione dipendente da SMAD4 è associata a una deregolarizzazione del controllo della crescita e a un’omeostasi tissutale compromessa, con frequente inattivazione genetica o funzionale riportata in molteplici tipi di tumore. Lo stato di SMAD4 viene inoltre utilizzato per studiare il crosstalk tra la segnalazione TGF-β e i programmi MAPK, PI3K–AKT e Wnt, che insieme determinano gli output trascrizionali.

Smad4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SMAD4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Smad4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SMAD4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SMAD4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Smad4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SMAD4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Smad4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Smad4 nelle cellule tumorali con espressione di SMAD4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.