SHIP-1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-421137-LAC

Inpp5d codifica SHIP-1 (inositolo 5-fosfatasi 1 contenente il dominio SH2), un regolatore negativo della segnalazione dei fosfoinositidi arricchito nelle cellule ematopoietiche, che idrolizza PI(3,4,5)P3 in PI(3,4)P2 e attenua l’output della via PI3K–AKT. Nelle linee immunitarie del topo, SHIP-1 contribuisce a modulare la segnalazione a valle di recettori quali i recettori Fc, i recettori per le citochine e le vie BCR/TLR, determinando le soglie di attivazione di cellule mieloidi e linfoidi. Attraverso il crosstalk con la segnalazione MAPK, i regolatori dell’apoptosi e i programmi citoscheletrici, influenza proliferazione, sopravvivenza, migrazione e produzione di mediatori infiammatori. L’attività deregolata di Inpp5d/SHIP-1 è ampiamente studiata nella disfunzione immunitaria e nei fenotipi associati all’infiammazione, rendendola rilevante per studi meccanicistici in modelli di macrofagi, microglia, cellule B e mastociti.

Le particelle di attivazione lentivirale SHIP-1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Inpp5d in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale SHIP-1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Inpp5d, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di SHIP-1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Inpp5d e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.