SAMD8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416890-ACT

SAMD8 (sterile alpha motif domain containing 8) è una proteina di membrana associata al reticolo endoplasmatico implicata nel metabolismo degli sfingolipidi, in particolare nella regolazione dell’interconversione tra ceramide e sfingomielina nell’ambito dell’omeostasi lipidica di membrana. Grazie al suo ruolo previsto nel controllo dei pool di sfingolipidi bioattivi, SAMD8 può influenzare la funzione del RE, la composizione delle membrane e i processi di segnalazione a valle legati alle risposte allo stress e alle decisioni sul destino cellulare. Un’alterazione dell’equilibrio degli sfingolipidi è una caratteristica ricorrente nella biologia delle patologie metaboliche, infiammatorie e neurodegenerative, così come nei fenotipi associati al cancro, rendendo SAMD8 un nodo utile per studi meccanicistici delle vie di segnalazione. La modulazione dell’espressione di SAMD8 aiuta a indagare come il rimodellamento lipidico del RE si interfacci con la segnalazione cellulare e con l’omeostasi degli organelli in sistemi cellulari umani.

SAMD8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SAMD8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SAMD8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SAMD8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SAMD8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SAMD8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SAMD8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SAMD8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SAMD8 nelle cellule tumorali con espressione di SAMD8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.