RPA 70 kDa subunit Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401454-ACT

RPA1 codifica la subunità da 70 kDa della replication protein A (RPA), un fattore ad alta affinità di legame al DNA a singolo filamento che stabilizza l’ssDNA esposto durante la replicazione, la ricombinazione e molteplici reazioni di riparazione del DNA. RPA1 coordina il reclutamento e l’attività di enzimi chiave per la manutenzione del genoma, supportando processi quali la protezione della forcella di replicazione, la riparazione per escissione di nucleotidi e la ricombinazione omologa, e interagisce con la segnalazione del danno al DNA dipendente da ATR durante lo stress replicativo. Modulando l’attivazione dei checkpoint e la scelta delle vie di riparazione, RPA1 contribuisce a preservare l’integrità genomica, e alterazioni della funzione o dell’espressione di RPA1 sono frequentemente studiate nel contesto dei fenotipi di instabilità genomica osservati in diversi modelli di malattia.

RPA 70 kDa subunit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RPA 70 kDa subunit Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RPA 70 kDa subunit. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RPA 70 kDa subunit nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RPA 70 kDa subunit nelle cellule tumorali con espressione di RPA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.