RNF4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422689-ACT

Il gene murino Rnf4 codifica RNF4, una ligasi E3 dell’ubiquitina mirata a SUMO che riconosce substrati poli‑SUMOilati tramite motivi di interazione con SUMO e ne promuove l’ubiquitinazione e la degradazione proteasomiale. RNF4 contribuisce a collegare la segnalazione mediata da SUMO al controllo qualità delle proteine dipendente dall’ubiquitina, influenzando le risposte al danno al DNA, lo stress replicativo e la regolazione della trascrizione attraverso la modulazione di fattori nucleari chiave. Controllando la stabilità delle proteine modificate da SUMO, RNF4 contribuisce al mantenimento dell’integrità del genoma e alla progressione del ciclo cellulare, processi spesso alterati nella trasformazione oncogena. La perturbazione di Rnf4 viene quindi utilizzata per studiare il crosstalk tra le vie SUMO–ubiquitina, la proteostasi nucleare e le reti di segnalazione adattative allo stress nelle cellule di mammifero.

RNF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Rnf4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RNF4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Rnf4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Rnf4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RNF4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Rnf4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RNF4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RNF4 nelle cellule tumorali con espressione di Rnf4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.