Ribosomal Protein L28 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405270-ACT

RPL28 codifica la proteina ribosomiale L28, un componente centrale della subunità maggiore 60S del ribosoma, necessario per un allungamento della traduzione accurato e per un’efficiente biogenesi ribosomiale. Nell’ambito della via di assemblaggio ribosomiale nucleolare, RPL28 sostiene la processazione dell’rRNA, la maturazione della subunità maggiore e la proteostasi, collegando la sua attività al controllo della crescita cellulare e alla riprogrammazione adattativa della traduzione in risposta allo stress. Un’espressione o un dosaggio alterati delle proteine ribosomiali possono perturbare la traduzione globale e selettiva degli mRNA e attivare la segnalazione di stress nucleolare, processi spesso studiati nella biologia del cancro e in altri disturbi che coinvolgono una sintesi proteica disregolata. RPL28 rappresenta quindi un utile punto di partenza per studiare la funzione del ribosoma, le reti di controllo della traduzione e gli effetti a valle sulla progressione del ciclo cellulare e sull’adattamento metabolico.

Ribosomal Protein L28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPL28 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ribosomal Protein L28 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPL28 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPL28, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ribosomal Protein L28. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPL28 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ribosomal Protein L28 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ribosomal Protein L28 nelle cellule tumorali con espressione di RPL28 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.