Ribophorin II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402599-ACT

RPN2 codifica la riboforina II, una subunità essenziale del complesso oligosaccariltransferasi (OST) nel reticolo endoplasmatico rugoso, che catalizza la glicosilazione N-linked co-traduzionale dei polipeptidi nascenti. Sostenendo la maturazione delle glicoproteine e il controllo qualità del RE, la riboforina II influenza il ripiegamento e il traffico proteico, nonché i percorsi di proteostasi che intersecano la segnalazione della risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response). Alterazioni della glicosilazione dipendente da RPN2 sono state associate a cambiamenti nella composizione dei recettori di membrana e nella dinamica del proteoma di superficie cellulare, rendendola rilevante per studi sull’adattamento allo stress e sulla segnalazione deregolata in modelli di malattia. Nei sistemi umani, la perturbazione di RPN2 è spesso utilizzata per indagare come la capacità di glicosilazione del RE influenzi la vitalità cellulare, l’adesione e la risposta a stimoli di via di segnalazione.

Ribophorin II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ribophorin II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ribophorin II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ribophorin II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ribophorin II nelle cellule tumorali con espressione di RPN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.