RhoB Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400875-ACT

Il gene umano **RHOB** codifica **RhoB**, una piccola GTPasi prenilata della famiglia Rho che agisce come regolatore a risposta rapida del rimodellamento del citoscheletro di actina, del traffico endosomiale e del turnover dei recettori di membrana. RhoB integra i segnali provenienti dai recettori dei fattori di crescita e dalle vie di stress cellulare per modulare la dinamica delle adesioni focali, la forma cellulare e la motilità attraverso effettori a valle che si interfacciano con programmi associati a ROCK e alle formine. Contribuisce inoltre alle risposte trascrizionali e di sopravvivenza influenzando gli output delle vie MAPK e PI3K/AKT, collegando la segnalazione prossimale alla membrana alle decisioni nucleari. Alterazioni dell’espressione o della regolazione di RHOB sono state associate a fenotipi legati al cancro, inclusi invasione, risposte allo stress terapeutico e variazioni nella suscettibilità all’apoptosi, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sulla plasticità delle cellule tumorali e sull’adattamento al microambiente.

RhoB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RHOB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RhoB Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RHOB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RHOB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RhoB. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RHOB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RhoB nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RhoB nelle cellule tumorali con espressione di RHOB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.