Rho 7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404094-ACT

L’RND2 umano codifica Rho 7, una piccola GTPasi atipica della famiglia Rho che regola il rimodellamento del citoscheletro di actina, la crescita dei neuriti e la dinamica di membrana attraverso la modulazione delle reti di segnalazione delle Rho GTPasi. L’attività di Rho 7 influenza la morfologia cellulare, la migrazione e l’adesione interfacciandosi con vie che coordinano la contrattilità del citoscheletro e il traffico vescicolare. RND2 è stato associato a programmi di neurosviluppo e differenziamento neuronale, e sono stati riportati pattern di espressione alterati in diversi contesti che coinvolgono una disregolazione della motilità cellulare e della segnalazione di sopravvivenza. Queste proprietà rendono Rho 7 un bersaglio utile per studiare processi dipendenti dal citoscheletro e programmi trascrizionali che plasmano l’identità cellulare e il movimento.

Rho 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RND2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Rho 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RND2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RND2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Rho 7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RND2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Rho 7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Rho 7 nelle cellule tumorali con espressione di RND2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.