PTPμ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403126-ACT

PTPRM codifica la fosfatasi tirosinica proteica di tipo recettoriale mu (PTPμ), una fosfatasi transmembrana a singolo passaggio che media l’adesione omofilica cellula‑cellula e collega i contatti extracellulari alla defosforilazione intracellulare delle tirosine. Tramite la regolazione dei complessi caderina–catenina e di substrati giunzionali, PTPμ influenza la funzione di barriera epiteliale ed endoteliale, la migrazione cellulare e l’organizzazione del citoscheletro. L’attività di PTPRM interseca la segnalazione dei recettori tirosin-chinasici e vie a valle quali MAPK e PI3K/AKT modulando soglie di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione. Alterazioni dell’espressione di PTPRM o del controllo della sua fosforilazione sono state associate a un’adesione deregolata e a fenotipi invasivi in molteplici contesti rilevanti per la malattia, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici sull’organizzazione tissutale e sull’equilibrio della segnalazione.

PTPμ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PTPRM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PTPμ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PTPRM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PTPRM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PTPμ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PTPRM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PTPμ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PTPμ nelle cellule tumorali con espressione di PTPRM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.