PLUNC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416774-ACT

BPIFA1 codifica PLUNC (palate, lung, and nasal epithelium clone), una proteina dell’immunità innata secreta, arricchita nell’epitelio delle vie aeree superiori e nel liquido di rivestimento della superficie delle vie aeree. PLUNC contribuisce alla difesa dell’ospite a livello mucosale modulando l’attività antimicrobica, influenzando la formazione di biofilm e regolando la tensione superficiale delle vie aeree e l’omeostasi della barriera epiteliale. L’espressione di BPIFA1 è collegata a programmi di differenziamento epiteliale e alla segnalazione infiammatoria nel tratto respiratorio, rendendolo rilevante per studi sull’infiammazione cronica delle vie aeree e sulla biologia delle infezioni. Livelli alterati di PLUNC sono stati associati a patologie delle vie aeree caratterizzate da un’immunità mucosale disregolata, tra cui asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva e rinosinusite cronica.

PLUNC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di BPIFA1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PLUNC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus BPIFA1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione BPIFA1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PLUNC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus BPIFA1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PLUNC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PLUNC nelle cellule tumorali con espressione di BPIFA1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.