PIPK I β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403758-ACT

PIP5K1B codifica la fosfatidilinositolo-4-fosfato 5-chinasi di tipo I beta (PIPK I β), una chinasi lipidica che genera fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2) nelle membrane cellulari. Il PI(4,5)P2 è un lipide di segnalazione centrale che regola il rimodellamento del citoscheletro di actina, la dinamica delle adesioni focali, il traffico vescicolare e la trasduzione del segnale dipendente dai fosfoinositidi attraverso vie quali PLC/IP3-DAG e PI3K-AKT. Attraverso questi processi, PIPK I β contribuisce alla migrazione cellulare, all’endocitosi e all’organizzazione di membrana, collegando l’omeostasi dei fosfoinositidi a cambiamenti dipendenti dal contesto nella proliferazione e nella funzione delle cellule immunitarie. Una segnalazione dei fosfoinositidi e un controllo del citoscheletro deregolati sono caratteristiche ricorrenti nella biologia dei tumori, negli stati infiammatori e nelle neuroscienze, rendendo PIP5K1B un nodo utile per studi meccanicistici della segnalazione prossimale alla membrana.

PIPK I β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIP5K1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PIPK I β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIP5K1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIP5K1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PIPK I β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIP5K1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PIPK I β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PIPK I β nelle cellule tumorali con espressione di PIP5K1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.