PIPK I α Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403490-ACT

PIP5K1A codifica la fosfatidilinositolo-4-fosfato 5-chinasi di tipo I alfa (PIPK I α), una chinasi lipidica chiave che genera fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2) a livello della membrana plasmatica e delle endomembrane. Il PI(4,5)P2 funge da precursore di secondi messaggeri nella segnalazione dei fosfoinositidi e regola direttamente il rimodellamento del citoscheletro di actina, l’endocitosi mediata da clatrina, il traffico di membrana e la dinamica delle adesioni focali. Attraverso il controllo della disponibilità di PI(4,5)P2, PIPK I α influenza nodi di segnalazione che includono le vie PLC/PKC e PI3K–AKT e supporta l’organizzazione spaziale della segnalazione guidata dai recettori. Una regolazione alterata del metabolismo dei fosfoinositidi e un’attività modificata di PIP5K1A sono state associate a migrazione cellulare aberrante, fenotipi invasivi e contesti di segnalazione oncogenica, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sui programmi di proliferazione e motilità.

PIPK I α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PIP5K1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PIPK I α Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PIP5K1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PIP5K1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PIPK I α. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PIP5K1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PIPK I α nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PIPK I α nelle cellule tumorali con espressione di PIP5K1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.