Pi16 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428732-ACT

L’inibitore della peptidasi 16 del topo (Pi16) codifica una proteina secreta simile a un inibitore delle proteasi seriniche, implicata nella regolazione della proteolisi extracellulare e del rimodellamento della matrice pericellulare. L’espressione di Pi16 è arricchita nei compartimenti stromali e nelle linee mesenchimali, collegandola alla biologia dei fibroblasti, ai programmi di riparazione tissutale e alla modulazione delle interazioni cellula–matrice che influenzano migrazione e differenziamento. Attraverso i suoi effetti sull’attività proteasica e sulla disponibilità dei segnali extracellulari, Pi16 è rilevante per vie che governano il rimodellamento associato all’infiammazione e le risposte fibrotiche. Un rimodellamento stromale disregolato e un’alterazione dell’equilibrio tra proteasi e inibitori sono caratteristiche ricorrenti in modelli di malattie cardiovascolari e polmonari, rendendo Pi16 un nodo utile per studi meccanicistici sulla regolazione del microambiente.

Pi16 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Pi16 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Pi16 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Pi16 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Pi16, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Pi16. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Pi16 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Pi16 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Pi16 nelle cellule tumorali con espressione di Pi16 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.